Proteinase mirip subtilisin (AprBp) dari Bacillus pumilus 3-19 adalah kandidat yang menjanjikan untuk penggunaan industri sebagai aditif pakan. Namun, untuk mendapatkan hasil enzim yang tinggi, perlu untuk mengembangkan sistem ekspresi yang sangat efisien.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan ekspresi gen protease B. pumilus 3-19 yang stabil dalam sistem ekspresi Pichia pastoris dan mengevaluasi korelasi aktivitas enzim dengan pilihan jenis vektor dan peptida sinyal. Dalam studi ini, untuk ekspresi stabil gen protease yang dioptimalkan dalam sel ragi methylotrophic, vektor pPINK-HC dan pPINK-LC dipilih. Untuk sekresi ekstraseluler protease rekombinan, satu set peptida sinyal efektif digunakan. Urutan faktor -kawin telah berulang kali menyebabkan peningkatan sekresi protein rekombinan. Di samping itu, urutan peptida sinyal pembunuh dan lisozim sebelumnya belum pernah digunakan untuk ekspresi protease bakteri di P. pastoris.
Koloni transforman dengan konstruksi berdasarkan vektor pPINK-LC terdeteksi pada hari ke-3 inkubasi dan menunjukkan efisiensi transformasi yang lebih tinggi daripada koloni dengan konstruksi berdasarkan vektor pPINK-HC, yang terdeteksi hanya pada hari ke-7 inkubasi. Efisiensi transformasi pada inkubasi hari ke-10 untuk struktur berdasarkan vektor pPINK-LC rata-rata 1,3×103 transforman/μg DNA, sementara 1,03×103 transforman/μg DNA direkam untuk konstruksi dengan vektor pPINK-HC. PCR koloni menunjukkan bahwa semua koloni transforman yang dipilih mengandung gen protease mirip subtilisin yang terintegrasi ke dalam genom ragi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu inkubasi mempengaruhi sintesis protease pada P. pastoris, dan aktivitas maksimum enzim diamati. Strain ragi dengan konstruksi berdasarkan vektor salinan rendah pPINK-LC menunjukkan aktivitas protease (U/ml) yang lebih tinggi dalam hidrolisis azocasein (2,63 ± 0,16 untuk peptida sinyal pembunuh (SP), 2,49 ± 0,08 untuk urutan faktor -kawin, 2,19 ± 0,11 untuk lisozim SP) dibandingkan galur dengan konstruksi berdasarkan vektor pPINK-HC (1,86 ± 0,09 untuk SP pembunuh, 2,21 ± 0,07 untuk urutan faktor -kawin, 1,31 ± 0,11 untuk lisozim SP), terlepas dari peptida sinyal mana yang digunakan. Aktivitas protease maksimum diperoleh untuk galur ragi dengan konstruksi pPINK-LC-killer-aprBp (5,75±0,08 U/ml) dan pPINK-LC-α-mat.factor-aprBp (4,33±0,07 U/ml).
Studi ini menunjukkan bahwa protease mirip subtilisin dari strain P. pastoris rekombinan menunjukkan aktivitas proteolitik, yang tergantung pada waktu inkubasi dan pilihan peptida sinyal dan vektor. Produksi protease basiler oleh sistem ekspresi berbasis ragi heterolog membuat sistem ini menjanjikan untuk pengembangan aditif pakan baru untuk peternakan.
Protease termasuk dalam tiga kelompok enzim industri terbesar dan menyumbang sekitar 60% dari total penjualan enzim secara global, 40% di antaranya milik bakteri protease. Protease serin bakteri memiliki spesifisitas substrat yang luas, dan ketahanan yang tinggi terhadap berbagai kondisi, yang menjamin penggunaannya dalam bioteknologi, khususnya sebagai bio-aditif untuk burung dan hewan ternak. Selain itu, melengkapi pakan dengan protease meningkatkan penyerapan asam amino oleh hewan dan menghemat dana untuk pembelian asam amino sintetis. Juga telah ditunjukkan bahwa penggunaan protease sebagai aditif pakan meningkatkan bioavailabilitas nitrogen, yang pada gilirannya mengurangi tingkat polusi amonia di dalam tanah. Juga, protease memfasilitasi aksi enzim lain dan meningkatkan efektivitas biaya pakan, serta mendorong pertumbuhan mikroflora yang bermanfaat dalam usus ayam pedaging.
Hari ini, sejumlah protease komersial dari produsen asing digunakan di Rusia. Perwakilan utama di pasar Rusia adalah aditif pakan impor CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), AMERIKA SERIKAT), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Swiss), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Jerman). Rekombinan yang diperoleh terdiri dari galur P. pastoris dengan gen subtilisin-like bacillary protease (aprBp) dan tiga peptida sinyal yang berbeda (faktor kawin-α, protein pembunuh dan lisozim). Ekspresi lebih lanjut dan pemurnian protease dari cairan kultur ragi dan studi sifat biokimia dan enzimatiknya akan membantu menilai prospek bioteknologi dari enzim rekombinan.
Baca lebih lanjut tentang studi, Ekspresi Heterolog Bacillus pumilus 3–19 Protease pada Pichia pastoris dan Potensi Penggunaannya sebagai Feed Additive dalam Peternakan Unggas
