oleh Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Grup Perusahaan Internasional Aqua biru, Thailand
Budidaya udang telah secara dramatis dipengaruhi oleh banyak penyakit patogen, terutama disebabkan oleh V. parahaemolyticus dan White Spot Syndrome Virus (WSSV). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi potensi penggunaan dua aditif pakan fungsional AlphaGuard*L Plus (Liquid) dan AlphaGuard*P (Powder) yang terdiri dari minyak esensial (eucalyptus, Timi, oregano milik keluarga Myrtaceae dan Lamiaceae masing-masing), Medium Chain Triglycerides (MCTs) dan senyawa bioaktif alami pada udang terhadap patogen penyebab penyakit, terutama V. parahaemolyticus dan WSSV.
Hasilnya menunjukkan bahwa AlphaGuard*L Plus efektif menunda perkembangan penyakit pada udang. Hasil ini menunjukkan bahwa aditif pakan fungsional AlphaGuard*P dan AlphaGuard*LPLUS dapat digunakan untuk meningkatkan pertahanan udang terhadap patogen.
pengantar
Praktek intensifikasi budidaya terkendala oleh kesehatan dan gizi yang mempengaruhi kinerja pertumbuhan. Untuk mengurai konsekuensi ini, aditif pakan fungsional telah digunakan untuk merangsang kekebalan udang dan meningkatkan kinerja udang khususnya untuk mengendalikan virus dan bakteri patogen dalam pengobatan terbaru penyakit udang seperti V. parahaemolyticus yang menyebabkan Penyakit Nekrosis Hepatopankreas Akut (AHPND) dan White Spot Syndrome Virus (WSSV) yang menyebabkan White Spot Penyakit (WSD), dikombinasikan dengan penerapan langkah-langkah biosekuriti.
Komposisi AlphaGuard yang menyusun MCT dan minyak esensial diakui sebagai praktik GRAS. Dalam studi ini, efisiensi produk AlphaGuard diperoleh dari kombinasi data hasil uji difusi cakram, tantangan penyakit dan histologi, bersama-sama dengan evaluasi efek produk AlphaGuard pada penyakit udang.
Bahan dan metode
Bakteri dan virus patogen
Dua patogen virulen pada udang, V. parahaemolyticus dan V. harveyi dalam stok gliserol, telah disubkultur dalam Tryptic Soy Broth (TSB) + satu persen NaCl, diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, sebelum digoreskan pada agar tiosulfat-sitrat-garam empedu-sukrosa untuk mendapatkan biakan murninya.
Suspensi WSSV dibuat dari otot udang yang terinfeksi WSSV. Secara singkat, otot udang yang mengandung WSSV dikeluarkan dari penyimpanan pada suhu -80 °C dan dipotong menjadi potongan-potongan yang seragam dalam kondisi steril dingin kemudian dihomogenkan dalam buffer TN (20 mM Tris-HCl, 400 mMNaCl, pH 7,4) pada 0,1 g/ml.
Setelah sentrifugasi pada 2, 000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C, supernatan diencerkan menjadi 1:100 dengan 0,9 persen NaCl dan disaring melalui 0,45 mikron. Supernatan yang dihasilkan disimpan pada suhu -80 °C, sampai digunakan sebagai sumber injeksi WSSV untuk eksperimen tantangan.
Aktivitas antimikroba
Tes difusi cakram
5 l AlphaGuard*L Plus dan AlphaGuard*P, konsentrasi mulai dari 0, 0,25, 0,5, pengenceran 1,0 dan 10 persen dengan NaCl 0,85 persen, diserap ke dalam diameter lima milimeter, Kertas cakram setebal 0,9 mm kemudian dikeringkan di udara sebelum dimasukkan ke dalam 105 sel kultur bakteri dalam cawan petri dengan lebar 100 x 15 mm. Larutan NaCl 0,85 persen digunakan sebagai kontrol negatif. Tiga piring ulangan untuk setiap perlakuan digunakan dan pengamatan dicatat setelah 24 jam.
Infeksi buatan V. parahaemolyticus dan penentuan jumlah Vibrio pada hemolimfa udang (HL) dan hepatopankreas (HP)
V. parahaemolyticus direaktivasi dari penyimpanan pada -80 °C dan dikultur dalam TSB + satu persen NaCl pada 37 °C semalaman. Kultur disentrifugasi pada 5, 000rpm selama 10 menit, untuk menghilangkan supernatan, dan pelet disuspensikan kembali dalam NaCl 0,85 persen steril hingga kepadatan 8,4 × 106 CFU/ml.
Udang, pada minggu kelima, terinfeksi dengan menyuntikkan 100 L suspensi bakteri ke dalam segmen perut kedua udang sehat pada minggu kelima budidaya dan kematian dicatat selama tujuh hari.
Udang dikumpulkan secara acak pada hari ketiga setelah infeksi untuk setiap perlakuan dan dicuci tiga kali dengan air steril. HL ditarik dari rongga perikardial menggunakan jarum suntik sekali pakai steril satu mL dalam kondisi steril dan ditambahkan ke volume yang sama antikoagulan steril (menambahkan 10 mM EDTA-Na2 ke 450 mMNaCl, 10 mMKCl, 10 mM HEPES, pH 7,3, 850 mOsm.kg-1 atau10 mM Tris-HCl, 250 mM Sukrosa, 100 mM Natrium sitrat, pH 7,6).
HL dan HP tanah diencerkan secara serial 10 kali lipat dengan PBS steril dingin. Setiap pengenceran disebarkan pada pelat agar TCBS yang ditempatkan terbalik dalam inkubator 37°C dan dikultur selama 16-20 jam. Pelat yang berisi 30-300 koloni bakteri dihitung, kemudian jumlahnya dicatat sebagai CFU/ml atau CFU/g.
Infeksi buatan dengan WSSV
ml filtrat disuntikkan secara intramuskular ke udang sehat pada minggu kelima budidaya. Udang dikumpulkan secara acak enam jam setelah infeksi untuk pemeriksaan histopatologi dan dicatat mortalitas selama tujuh hari.
Kondisi pertumbuhan udang dan kelompok percobaan
Udang dibeli dari peternakan lokal Thailand. Mereka diuji negatif untuk V. parahaemolyticus-penyebab AHNPD dan WSSV dengan analisis PCR. Setelah aklimatisasi selama satu minggu di akuarium, sebelum percobaan, Udang yang tampak sehat dengan panjang badan seragam dibagi secara acak menjadi tiga kelompok dengan enam ulangan per kelompok, 20 udang per ulangan.
Kapasitas akuarium adalah 100 liter, berisi 60 liter air laut. Properti air asin dipertahankan pada 15 ppt, pH 7,7-8,0 dan DO>4,0 mg/L. Setiap perlakuan berisi juvenil udang dengan bobot awal rata-rata 2,6 g yang ditebar secara acak di setiap tangki.
Udang diberi makan sampai kenyang hingga sekitar 2,5-3 persen dari berat tubuhnya, tiga kali sehari selama lima minggu. Pemberian pakan disesuaikan setiap hari, sesuai dengan tingkat yang mereka konsumsi, untuk memastikan bahwa pakan benar-benar dikonsumsi. Sebelum memberi makan, ganti kulit, kotoran, dan udang mati dibuang, 20 persen air di setiap tangki diganti setiap tiga hari dengan air laut baru.
Diet eksperimental dan pengumpulan data
Semua kelompok disimpan, selama percobaan, dalam kondisi yang sama seperti aklimatisasi. Kelompok kontrol diberi pakan pelet udang komersial, dilapisi dengan kitin-kitosan satu persen. Kelompok perlakuan diberi makan dengan AlphaGuard*L Plus yang disemprotkan atau AlphaGuard*P, dicampur dengan pelet udang komersial dan dilapisi oleh kitin-kitosan satu persen, pada dosis 5.0 ml atau g/Kg pakan. Parameter mortalitas dan kualitas air dicatat setiap hari. Di akhir persidangan, tingkat kelangsungan hidup dievaluasi.
Analisis statistik
Unit percobaan analisis statistik, tank, dan akuarium didistribusikan secara acak lengkap. Data kuantitatif diperiksa untuk normalitas dan homoskedastisitas. Data dianalisis menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) untuk mencari perbedaan yang signifikan (p <0,05) di antara rata-rata perlakuan.
Hasil
Aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram dan dimasukkan dalam pakan udang terhadap ketahanan penyakit AlphaGuard*L Plus atau AlphaGuard*P
Tes difusi cakram
Konsentrasi AlphaGuard*L Plus dan AlphaGuard*P setidaknya satu persen menghambat V. harveyi dan V. parahaemolyticus, Namun, ada efektivitas penghambatan yang lebih tinggi untuk V. parahaemolyticus dibandingkan dengan V. harveyi. Konsentrasi efektif AlphaGuard mungkin telah diturunkan jika kita mengencerkan dalam pelarut lipid, seperti etanol, untuk pengujian.
Komposisi minyak atsiri, teknik pengujian dan cara kerjanya telah ditinjau secara intensif. Studi ini tidak menyelidiki detail molekuler untuk mekanismenya, Namun, efek utama dari sifat bakteriosidal mungkin terkait dengan gangguan mereka terhadap integritas membran dan permeabilitas sebagai senyawa lipofilik dari minyak esensial dan MCT.
Asam lemak yang berbeda dalam MCT memiliki konsentrasi hambat minimum yang berbeda (MIC), tergantung pada jenis asam lemak, mikroorganisme, dan pH lingkungan. Aspek sinergis dan antagonis antara bahan-bahan dalam AlphaGuard tidak dijelaskan dalam penelitian ini. Minyak atsiri dalam AlphaGuard juga bertindak sebagai antioksidan untuk mencegah atau memperlambat oksidasi MCT tak jenuh untuk memperpanjang umur simpannya selain anti-stres pada udang.
Tes tantangan V. parahaemolyticus
Pada akhir percobaan percobaan pakan, udang ditantang oleh V. parahaemolyticus. Tingkat kematian kumulatif diplot (lihat gambar dua). Hasil angka kematian, setelah tantangan V. parahaemolyticus selama interval tujuh hari, menunjukkan bahwa kelompok udang yang diberi makan AlphaGuard*P dan AlphaGuard*L Plus memiliki angka kematian yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol setelah hari keempat infeksi.
Baik AlphaGuard*P dan AlphaGuard*L Plus memiliki angka kematian statistik yang sama setelah hari kelima infeksi. Di akhir percobaan, sebaliknya, tingkat kelangsungan hidup secara statistik tidak berkorelasi dengan tingkat kematian untuk AlphaGuard*P, (lihat gambar tiga).
Kemampuan pembersihan udang dari Vibrio spp. setelah tiga hari infeksi diplot, (lihat gambar empat). Hasilnya menunjukkan bahwa Vibriospp. jumlah hemolimfa udang yang diberi makan AlphaGuard*P dan AlphaGuard*LPlus lebih rendah daripada kelompok kontrol. Kemampuan udang untuk bertahan melawan bakteri di HP, diberi makan oleh AlphaGuard*LPlus, juga memiliki kemampuan bertahan yang jauh lebih baik daripada udang yang tidak diberi makan AlphaGuard.
Tes tantangan WSSV
Uji tantang WSSV dilakukan setelah lima minggu uji coba pakan. Kematian kumulatif diplot, (lihat gambar lima). Kelompok udang yang diberi pakan AlphaGuard*L Plus menunjukkan penundaan kematian yang signifikan, dibandingkan dengan kelompok kontrol dan AlphaGuard*P-fedshrimp selama kedua mereka, hari ketiga dan keempat, (lihat gambar enam).
Hal ini bertepatan dengan tidak adanya tanda histopatologi jaringan infeksi WSSV pewarnaan H&E di area injeksi, kecuali generalisasi nekrosis otot yang kemungkinan terkait dengan mekanisme pertahanan udang setelah tiga hari infeksi. Namun demikian, semua kelompok berakhir dengan kematian 100 persen.
Kesimpulan
Hasil uji coba ini menunjukkan bahwa aplikasi feed additive AlphaGuard*P dan AlphaGuard*L Plus 0,5 persen dengan pakan komersial terbukti efektif dalam meningkatkan pertahanan udang terhadap patogen. AlphaGuard*L Plus secara khusus menampilkan performa yang lebih baik.
